2.A Manual de Procedimientos:
Balance del Contenido Vaginal (BACOVA 2007)
Vigente desde el 1 de setiembre 2007
al 31 de agosto 2008
De acuerdo a la planificación del proyecto BACOVA y en función de las propuestas de optimización al Manual de Procedimientos 2006/7, se ha estructurado la versión actual BACOVA 2007/8, vigente hasta el 31 de agosto de 2008.
SE INSISTE EN LA NECESIDAD DE NORMATIZAR Y CUMPLIR A RAJA TABLA LOS MANUALES DE PROCEDIMIENTO APROBADOS.
ÚNICO CAMINO PARA GARANTIZAR LA MÁXIMA CALIDAD A NUESTROS PACIENTES, OPTIMIZAR LA CONFIABILIDAD MEDICA Y CONCRETAR ARANCELES DIGNO
MANUAL DE PROCEDIMIENTO BACOVA 2007/8
INTRODUCCIÓN
Se continúa con la metodología de aprendizaje entre pares y las modificaciones que se introducen en el Manual de Procedimientos BACOVA 2007/2008, están basadas en el estudio y consenso de todas las opiniones recibidas de participantes activos del Taller Participativo Nominal BACOVA, desde su inicio en el 2004 a la actualidad.
La versión actual contiene muy pocas modificaciones, con respecto a la anterior.
La consolidación de la validez del estudio parcial de BACOVA (VN y RIV) en muestras conservadas en medio de Stuart, la necesidad de observar la necesidad de aplicar la determinación de la Reacción Inflamatoria Vaginal, mediante el recuento de leucocitos por célula epitelial por campo microscópico, en casos especiales y datos de interés en el manejo del informe.
Hay otras modificaciones menores, por lo que recomendamos una nueva lectura crítica integral del Manual de Procedimientos y la convocatoria permanente para que nos envíe su opinión a los efectos de optimizar la calidad.
INDICE
1.0.-POBLACIÓN A LA QUE ESTÁ DESTINADO EL ESTUDIO
Y DECISIÓN EN LA SOLICITUD DEL ANÁLISIS.
2.0.-TOMA Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA.
3.0.- PROCESO DE LABORATORIO.
4.0.-SECUENCIA DE TRABAJO RECOMENDADA PARA EL ESTUDIO MICROSCÓPICO Y DOCUMENTACIÓN INTERNA DE RESULTADOS.
5.0.-INFORME DEL ESTUDIO
6.0.-ANEXOS
6.1.-Toma de Muestra
6.2.-Coloraciones
6.3.-Determinación del Valor Numérico
6.4.-Apoyo para el desarrollo de documentación interna
6.5.-Morfotipos Extraños
6.6.-Reacción Inflamatoria Vaginal y Células guía
6.7.-Levaduras
Abreviaturas:
CG Células Guía
DV Disfunción Vaginal
Le Levaduras
Mex Morfotipos extraños
OA Olor a Aminas
RIV Respuesta inflamatoria Vaginal
TGI Tracto Genital Inferior
TV Tricomonas
VB Vaginosis Bacteriana
VMI Vaginitis Microbiana Inespecífica
VN Valor Numérico
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACOVA 2007/8.
(Válido hasta agosto 2008)
1.0.-POBLACIÓN A LA QUE ESTÁ DESTINADO EL ESTUDIO Y
DECISIÓN EN LA SOLICITUD DEL ANÁLISIS.
La información que se genera con BACOVA está destinada para la atención primaria de la mujer en edad fértil (embarazada o no).
Debe ser realizada como estudio de base en la primera visita, toda vez que el clínico requiera el estudio complementario de laboratorio para evaluar el riesgo gineco obstétrico de la mujer.
Criterio de exclusión
Es de capital importancia tener en cuenta que en la atención de prepúberes, mujeres perimenopáusicas, menopáusicas y aquellas que se encuentren con tratamiento hormonal de cualquier tipo, los valores predictivos positivo y negativo de BACOVA, para el diagnóstico puntual de vaginosis bacteriana no están validados. Con respecto a los otros criterios que informa BACOVA (VMI,TV, Mex, Le y RIV) mantiene los valores predictivos en toda mujer independiente de su edad.
Nomenclatura
La solicitud de estudio desde el área médica del primer examen de la función vaginal, debe unificarse y resumirse en: Balance del Contenido Vaginal y/o utilizando preferentemente la sigla BACOVA.
Recomendamos la expresión de DISFUNCIÓN VAGINAL, para englobar la gama de patologías del tracto genital inferior (TGI), que generan los síntomas y signos característicos que llevan a la mujer en edad fértil a la consulta médica.
Decisión de la solicitud de BACOVA
Dada la cantidad significativa de disfunciones vaginales asintomáticas, BACOVA debe indicarse en la primera consulta de toda mujer en edad fértil, en la que el clínico sospeche alteraciones y/o detecte pH u olor anormales.
En todo caso de control ginecológico o prenatal.
En todo caso de intervenciones en el tracto genital inferior (colocación de DIU)
Percepción de la DV por parte de las pacientes:
Los signos y síntomas más frecuentes que inducen a la consulta son: mal olor, picazón,
sensación de quemadura, irritación, edema en la región vulvovaginal, con la presencia o no de secreción vaginal anormal (“flujo”),eritema de la región vulvar, eventual disuria, dispareunia y/o dolor en la región pélvica.
Percepción de la DV por parte del equipo de salud:
Los síndromes reconocidos en la actualidad, vinculados directamente con DV y con mayor prevalencia son: vaginosis bacteriana, vaginitis microbiana inespecífica (vaginitis aeróbica de Donders), vulvovaginitis por levaduras, vaginitis por infección por tricomonas, y vaginitis atróficas y vinculadas a otros procesos patológicos. (patología de la piel), vulvodinia.
2.-TOMA Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA.
2.1.-Condición de exclusión absoluta
No se deberá tomar la muestra en los tres días anteriores, durante o antes de transcurridos cinco días después de la menstruación.
2.2.- Hisopos
El hisopo a utilizar no requiere características especiales y debe ser estéril tan solo para garantizar la bioseguridad a la paciente. Debe garantizarse la estandarización del tipo de hisopo a usar, de forma de asegurar uniformidad para todos los estudios y la misma cantidad y moldeado del algodón hidrófilo utilizado. El mango puede ser de madera, plástico o metálico.
Se utilizarán dos hisopos por toma. Deben conservarse en tubos de ensayo escrupulosamente limpios y preferentemente estériles.
Una vez tomada la primera muestra se introduce el hisopo en el tubo. Es conveniente efectuar los extendidos inmediatamente, para evitar la desecación.
Con el segundo hisopo también conservado en un tubo estéril, se hace una segunda toma de fondo de saco y se introduce en otro tubo conteniendo 0.5 ml de solución Fisiológica estéril.
Ambos tubos deben identificarse y se envían juntos al área de proceso, con los datos elementales de la mujer que se explicitan más adelante.
2.2.1.- Transporte en medio de Stuart.
Se ha determinado la validez del estudio BACOVA en una muestra tomada y transportada en medio de Stuart a los efectos de la determinación del Valor Numérico y la RIV. Se omite el examen en fresco, el VN se realiza en la misma forma que en la toma convencional de la muestra, pero la RIV se debe evaluar mediante el recuento de leucocitos, por célula epitelial por campo microscópico en la coloración de Giemsa.
2.3.- Información a la paciente.
El problema de toma de muestra es uno de los puntos críticos en el intento de normatizar el estudio de la DV mediante BACOVA.
A continuación se presenta un borrador de la posible utilización de información preimpresa para la paciente, lo que en muchos casos resulta imposible cumplir, por el sistema de cobertura de la paciente y/o quien y donde se toma la muestra.
Propuesta de información que debe proporcionarse a la paciente, preferentemente por escrito o, en su defecto, explicada verbalmente.
En todo caso asegurar que la paciente ha comprendido la importancia de cumplir las indicaciones.
Información general :
Consentimiento Informado
La paciente debe saber que BACOVA requiere la toma de una muestra de fondo de saco de la cavidad vaginal sin necesidad de ningún tipo de punción.
Se informará a la paciente que deberá abstenerse de mantener relaciones sexuales desde 48 horas antes de la fijada para la toma de muestra.
No deberá utilizar ningún tratamiento local vaginal desde cinco días antes o desde el tiempo que hubiera indicado el médico solicitante, quien deberá evaluar el resultado obtenido en función de esta variable. Toda medicación que la paciente deba mantener, deberá ser consignada en “aclaraciones sobre la muestra”, al elaborar el informe.
Deberá asegurar la no interferencia con el período menstrual.
No deberá utilizar duchas vaginales, uso de tampones, ni ningún cosmético intimo desde cinco días antes de la toma de la muestra. La higiene previa, en el día de toma de la muestra debe ser de la región externa genital sin usar otro aditivo que jabón común.
En el caso de secreción vaginal abundante (“flujo”), podrá utilizar apósitos descartables y usar uno hasta el momento de la toma de muestra.
No existe ninguna restricción sobre la emisión de orina, pero es preferible orinar una hora antes de la toma de la muestra.
Estandarizar en lo posible, la toma de muestra en la etapa ovulatoria del período menstrual y la hora del día, sobre todo en el caso de seguimiento de la evolución, en una misma paciente.
La paciente deberá solicitar toda aclaración referente a sus obligaciones y dar su consentimiento y compromiso de cumplir todas las indicaciones. |
Esta información debe ser entregada a la paciente acompañando la solicitud de estudio en el área clínica y/o al tomar contacto con el laboratorio.
Esta etapa debe ser cumplida, preferentemente, en el momento de la decisión clínica del estudio y verificada en el momento de obtención de la muestra.
Estas son condiciones ideales que en la mayoría de los casos no se cumplen.
Previamente a la toma de la muestra, deben verificarse las condiciones de admisión básicas para obtener la misma. Existen casos en que el médico tratante requiera un inmediato estudio y alguno de los requerimientos no se cumple, en este caso el informe deberá ir acompañado de las aclaraciones respectivas.
Se debe hacer un esfuerzo permanente, entre todos los actores de la atención primaria de la mujer, para mejorar las condiciones éticas y técnicas de toma de muestra, de todas las pacientes, independiente del sistema social de atención al que pertenecen.
2.4.- Datos mínimos de la paciente
y validación de la muestra.
Los datos mínimos de la paciente que deben acompañar infdefectiblemente la muestra y para lo que recomendamos utilizar un formulario preimpreso, son:
Solicitud
de exámen
de Balance del Contenido Vaginal (BACOVA) |
| Edad: |
Años: |
FUM |
|
Embarazada: |
SI |
NO |
Sintomática: |
SI |
NO |
Cumple todos los requerimientos |
SI |
NO |
Hora de toma de la muestra: |
|
|
Hora de proceso de la muestra: |
|
|
Validación de la muestra: |
Aclaración sobre problemasasociados a la muestra: |
Una vez verificada y documentada la información
relacionada con el estado actual de la paciente y su identificación,
se procede a la toma de la muestra.
2.5.- Toma de la muestra
2.5.1.- Bioseguridad
Se asegurará que todas las exigencias de bioseguridad estén controladas en todo el proceso de toma, transporte y proceso de la muestra.
2.5.2.- Procedimiento básico de la toma.
Se colocará a la paciente en posición ginecológica y una vez introducido correctamente el espéculo, con suficiente iluminación, se localizará la posición del cuello de útero y se verificará la posibilidad de acceso directo al espacio virtual existente por debajo del mismo o fondo de saco vaginal. De no existir ningún tipo de anomalía anatómica manifiesta que lo impidiera, se procederá a introducir el hisopo y tomar con movimientos rotatorios (sin presionar sobre las mucosas vaginales), material de la secreción acumulada en ese sitio. Se debe evitar tocar las paredes del espéculo o la región externa vaginal al retirar el hisopo.
Aun en condiciones de un escaso volumen líquido acumulado en el fondo de saco, debe evitarse el “raspado” de la mucosa vaginal.
Con los hisopos se procede como fue indicado en el punto 2.2 (hisopos).
2.6.-Transporte de la muestra
Se verifica que el rótulo exterior de los tubos coincida con los datos de identificación fehaciente de la paciente en estudio y se envía al área de proceso de laboratorio. El traslado debe ser ibnnediato.
De no ser posible, la muestra debe ser conservada a temperatura ambiente (20 +/- 5 grados) evitando el enfriamiento o que sea sobrecalentada.
Lo ideal es procesar la muestra destinada al estudio en fresco (hisopo en tubo con 0.5 ml de SF), en el plazo no mayor de una hora a partir de obtenida.
3.- PROCESO DE LABORATORIO.
3.1.- Preparación del material de estudio Microscopico.
La secuencia racional del proceso de laboratorio comprende:
3.1.1.- Preparación para examen en fresco.
Se trabaja con el hisopo que se encuentra en el tubo con 0.5 ml de solución fisiológica estéril. Homogeneizar manualmente, tratando de transferir la mayor cantidad de material a la fase líquida. Colocar “gotas” de la suspensión entre porta y cubreobjetos para la observación en fresco.
Esta etapa requiere el mayor esfuerzo operativo para que la preparación y lectura microscópica se realicen lo antes posible, lo que aumenta la sensibilidad del diagnostico de TV y bacterias móviles y estabilidad de la morfología celular.
3.1.2.- Preparación de extendidos para la tinción de Gram
Utilizando el hisopo sin agregado de SF, se hacen extendidos en portaobjetos desengrasados, limpios y secos, generando una capa fina. Se fija por calor y se procede a la tinción de Gram Ver anexo 2.
3.1.3.- Preparación de extendidos para la tinción de Giemsa
Se utiliza el mismo hisopo usado para la coloración de Gram. El extendido requiere un proceso de fijación distinto y crítico. Anexo 2.
Es siempre recomendable realizar los extendidos en forma inmediata a la recepción de la muestra, en forma simultánea a la realización de la preparación en fresco.
La realización de las tinciones (post fijación) permiten un espacio de tiempo en el que se puede completar la lectura del preparado en fresco.
4.0.-SECUENCIA DE TRABAJO RECOMENDADA PARA EL ESTUDIO MICROSCÓPICO Y DOCUMENTACIÓN INTERNA DE RESULTADOS.
4.1.- Exámen en fresco.
Se recomienda iniciar la lectura con aumento de 400X, para tener la imagen global y verificar la validez de la muestra tomada.
Se deberán hacer anotaciones ordenadas y precisas. El examen en fresco tiene un gran valor agregado y ante la imposibilidad de disponer de coloraciones accesorias, sistematizando y profundizando el análisis adquiere un alto nivel predictivo.
Se debe concentrar el estudio sobre los siguientes criterios:
a.- Apreciación global de la relación de lactobacilos y resto de la microbiota anaeróbica habitual, generando un VN preliminar de apreciación subjetiva, que oriente a ubicar el preparado en una de las tres categorías numéricas, de 0 a 3/ 4 a 6/ 7 a 10. Este resultado será verificado luego mediante el recuento relativo estandarizado en el Gram.
b.- Detección de bacterias móviles compatibles con Mobiluncus
c.- Presencia de levaduras.
d.- Presencia de Tricomonas.
e.- Apreciación global preliminar subjetiva, de la relación de Leucocitos por campo y Leucocitos por Célula Epitelial por campo microscópico, con aumento de 400X. Generar una cifra de aproximación que va a ser nuevamente evaluada al leer la coloración de Gram y finalmente confirmada por un minucioso estudio en el Giemsa, en el caso de ser necesario.
f.- Detección de morfotipos bacterianos extraños.
g.-Prolija evaluación de la presencia de células guía y células “redondas” o francamente distintas de aquellas epiteliales típicas, de presencia habitual en el contenido vaginal normal.
h.- Toda otra evidencia anormal que se detecte.
4.2.-Lectura del Gram.
4.2.1.-Lectura del Gram para generar el informe de valor numérico (VN) .
Se establece con seguridad el VN de 1 a 10 de acuerdo al estudio de los
morfotipos de la microbiota habitual vaginal (Anexo 3 y Anexo 4).
4.2.2.- Lectura del Gram para generar el informe sobre Morfotipos Extraños (Mex)
Analizar la presencia de Mex, es decir formas bacterianas diferentes de las especies de la microbiota habitual.
Utilizar en forma combinada el juego de aumentos de 400X y 1000X para tener una visión global de la distribución relativa y una aproximación sobre el o los morfotipos presentes.
Los Mex se sistematizan en cuatro grupos: cocos y/o bacilos Gram positivos, bacterias Gram negativas, corineformes y formas compatibles con Actinomyces.
Por el momento se obvia informar “cantidad”, ya que no genera ningún aumento del valor predictivo. (anexo 5)
4.2.3.-Lectura del Gram para establecer el Número de Leucocitos por campo (Lpc) con aumento de 1000X.
Con una clara visión panorámica previa (400X) de la calidad del preparado, se eligen las zonas más apropiadas (frotis homogeneo) y luego, con aumento de 1000X, se procede a la evaluación cuantitativa de Lpc. Se deberán analizar no menos de cinco campos, no adyacentes. De obtenerse valores de dispersión racionales, se calcula e informa el promedio obtenido, informando un número único. Si es necesario se realizará el estudio de otros cinco campos más.
En el caso de obtenerse una cifra de más de cinco Lpc, se deberá completar el recuento de Leucocitos por célula epitelial por campo, en el extendido teñido con Giemsa, utilizando un aumento de 400X.
4.3.- Lectura de la coloración de Giemsa.
Se manejan dos criterios analíticos separables. El primero para una revisión general y búsqueda avanzada y el otro cuando necesario, incluye la evaluación cuantitativa de Leucocitos por célula epitelial por campo.
4.3.1.-Etapa confirmatoria y búsqueda adicional.
Esta etapa del proceso puede llamarse confirmatoria y significa:
a.- Verificar la presencia o no de Tricomonas.
b.- Revisar la presencia o no de Levaduras.
c.- Verificar la impresión sobre presencia de morfoipos extraños.
d.- Confirmar o descubrir la detección de CG
e.- Confirmar la racionalidad del VN aproximado por la lectura del fresco y determinado por el estudio en el Gram.
4.3.2.-Valor de la relación de leucocitos por célula epitelial por campo.
En el caso de tener un número de Leucocitos por campo superior a 5, en el estudio de la coloración de Gram (1000X), se procederá a la evaluación cuantitativa del número de leucocitos por célula epitelial, por campo microscópico a 400X , en el extendido teñido por Giemsa. Esta etapa es fundamental para aumentar la evidencia sobre RIV. (Anexos 2 y 6)
4.4.- Corrección del VN por la adición de dos puntos en caso de la detección de células Guía, para Vaginosis Bacteriana.
ntegración de las evidencias obtenidas en la lectura de todos los extendidos. Anexo 6
La detección de CG independiente de su número debe significar la corrección del valor numérico cuando este se ubica entre 0 a 6. Valores numéricos de 7 o más son considerados de hecho VB y no requieren corrección.
4.5.- Reacción Inflamatoria Vaginal (anexo 6)
Se deberá confirmar con el mayor juicio crítico la cifra de Lpc (Base tinción de Gram) y en caso de ser superior al valor 5 ó en situación de que los resultados del estudio lo aconsejen, se completará la evaluación de Leucocitos/célula epitelial, confirmado en base a la coloración de Giemsa. Ambos valores representan el criterio con mayor valor predictivo positivo y negativo en el diagnóstico de la DV y por ende en el que define la orientación del manejo clínico de la mujer en edad fértil con riesgo gineco obstétrico.
Se deberá informar la presencia de células no habituales del contenido vaginal (Células “redondas”). No se pretende que el informe refiera a diagnóstico cito-histológico. Significa la obligación ética y científica de informar la presencia de células que indican la instalación de patologías agudas o crónicas que deben ser inmediatamente confirmadas o no, en niveles de mayor complejidad.
Se reitera la necesidad de buscar la existencia de células ajenas al contenido vaginal normal, que podrán ser llamadas células “no habituales en el contenido vaginal”, incluyendo coilocitos (vinculados a infección por HPV), virocitos (células compatibles con infección herpética y otras células (“redondas”) que indican patologías que van desde una reacción inflamatoria manifiesta (células parabasales) y/o procesos de atrofias de mucosas y formas proliferativas epiteliales, que deberán ser confirmadas clínica y analíticamente. (Anexo 6)
4.6.- Conclusión definitiva sobre la detección
de Tricomonas.
La búsqueda clásica de TV es en el estudio en fresco, donde son identificadas con mayor sensibilidad y especificidad en función de la detección de su movilidad. En el caso de no detectarse en fresco y sobre todo en presencia de una respuesta inflamatoria significativa, deberá buscarse cuidadosamente su presencia en los extendidos coloreados con Gram (baja sensibilidad y especificidad) y con más detenimiento en los teñidos con Giemsa, de mayor eficiencia (confirmatorio).
4.7.- Conclusión definitiva sobre la detección de levaduras
y su significación.
La presencia de levaduras es de fácil identificación. La interpretación de cuando las levaduras detectadas son responsables de la etiología de una vulvovaginitis escapa al valor predictivo de la sola detección morfológica. Independiente de la apreciación cuantitativa e inclusive detalles morfológicos vinculados con actividad reproductiva (dimorfismo). La sola detección microscópica de levaduras no tiene un valor predictivo (positivo y negativo) válido para tomar decisiones terapéuticas.
Sin embargo en BACOVA, la visualización de Le, asociada a la RIV(recuento de Lpc en Gram 1000X) cobra mayor valor predictivo positivo y negativo . (Anexo 7)
5.-INFORME DEL RESULTADO
El informe debe ser predictivo y no descriptivo.
Se recomienda organizar la documentación interna en el orden antes presentado, que representa un verdadero algoritmo de las evidencias detectadas.
Es muy apropiado disponer de una ficha preimpresa donde registrar paso a paso los hallazgos detectados a lo largo de la lectura de los diferentes preparados.
El informe debe sintetizar resultados concretos a los efectos de orientar decisiones en el manejo clínico terapéutico de la paciente, pero antes se deben analizar en forma integral las evidencias obtenidas y su contribución a los criterios diagnósticos que se desprenden del estudio morfológico.
Se reitera que el informe no debe ser descriptivo y debe orientar decisiones clínicas concretas, utilizando códigos numéricos de aceptación internacional.
Un modelo estándar válido para este informe se presenta a continuación:
ESTUDIO INTEGRAL DEL CONTENIDO VAGINAL:
BACOVA:
Estudio del Balance del Contenido
y de la Respuesta Inflamatoria Vaginal:
Apellido y Nombre de la paciente:
|
| Fecha del estudio: |
| Datos preanalíticos: |
| Edad: |
años |
FUM |
|
Embarazada: |
SI |
NO |
Sintomática: |
SI |
NO |
Cumple todos los requerimientos |
SI |
NO |
Hora de toma de la muestra: |
|
|
Hora de proceso de la muestra: |
|
|
Validación de la muestra: |
|
Aclaración sobre problemas asociados a la muestra: |
|
Estudio del equilibrio de la microbiota vaginal:
Interpretación de la coloración de Gram según criterio Nugent
y con corrección de Lanzafame
| Valor Numérico de Nugent |
|
Células Guía- clue cells |
SI |
NO |
Valor Numérico Final |
|
* Interpretación:
a. 0 a 3 Microbiota Normal
b. 4 a 6 Microbiota Intermedia
c. 7 a 10 Microbiota Anormal. En ausencia de Reacción Inflamatoria Vaginal define el estado de Vaginosis Bacteriana.
Estudio de Respuesta inflamatoria vaginal:
Criterios analizados |
Número de leucocitos |
Linea de corte.
Leucocitos |
Leucocitos / campo (1000X) lextura en Gram |
|
CINCO |
Leucocitos / campo (400X) lectura en Giemsa |
|
DIEZ |
Leucocitos/célula epitelial/campo(400X) Giemsa |
|
UNO |
Interpretación parcial:
Un valor numérico mayor de 4, asociado a Reacción Inflamatoria Vaginal orienta al estado de Vaginitis Microbiana Inespecífica.
Presencia de células no habituales |
SI |
NO |
Hematíes |
|
|
Células compatibles con Virocitos: |
|
|
Células compatibles con Coilocitos: |
|
|
Otras Células no habituales: |
|
|
Estudio de Vaginitis convencionales:
Criterios analizados |
SI |
NO |
Tricomonas |
|
|
Levaduras (presencia significativa) |
|
|
Informe detallado de Morfotipos:
Observaciones:
CONCLUSION:
La Dirección Técnica del Laboratorio ha implementado el Manual
de Procedimientos BACOVA SALUD REPRODUCTIVA, de la Fundación Bioquímica Argentina (www.fba.org.ar/proeco) para el estudio
de la disfunción vaginal. Ante cualquier duda sobre el resultado
y/o interpretación del presente informe no dude en contactarnos.
ESTE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS ESTA VIGENTE A PARTIR DEL 1º DE SETIEMNBRE DE 2007, HASTA EL 31 DE AGOSTO DE 2008.
TODO PROFESIONAL INTERESADO PUEDE HACER CRÍTICAS
Y PROPUESTAS, QUE SON EVALUADAS EN FORMA PERMANENTE
POR EL GRUPO DE COORDINACION DEL PROYECTO BACOVA.
ANEXO I
Consideraciones especiales sobre TOMA DE MUESTRA
Muestras en medio de Transporte de Stuart
Se ha demostrado (Ver trabajo en la pagina www.fba.org.ar en PROECO, BACOVA , Resultados)
que en muestras tomadas sobre medio de Stuart y consrvadas hasta cuatro horas, el VN es válido y la RIV requiere el análisis de leucocitos por célula epitelial por campo. El recuento directo de leucocitos por campo genera valores inferiores a los relaes.
Información a la Paciente
No se ha avanzado en estudios de validacióin de tomas de mnuestras no convencionales:
a.- Muestra tomada sin espéculo.
b.- Muestra tomada con hisopo y estudiada más de 24 horas más tarde (rehidratada)
c.- Muestra tomada por la propia paciente (sin especulo) y enviada por sistema de correo (rehidratadas).
Existen publicaciones sobre estos procedimientos que indican su potencial utilidad, pero aun no es posible incorporarlas en nuestro manual de procedimientos, ya que necesitan una confirmación de
su validez en nuestro medio.
Estamos en condiciones, de existir interesados, en coordinar un proyecto de evaluación de uno cualquiera de estos sistemas.
Si usted desea obtener más información diríjase a la coordinación del Proyecto.
ANEXO 2
Técnicas de Coloraciones
COLORACION DE GRAM
Reactivos:
1 – Violeta de Genciana fenicado:
Violeta de Genciana: 10 g.
Fenol: 20 g.
Alcohol absoluto (96°): 100 ml.
Agua dest./ CSP 1000 ml.
Disolver el violeta con el fenol previamente fundido a Baño María, en un vaso de precipitado de 2 litros destinado para colorantes, al que se añade el alcohol. Dejar hasta completa disolución aproximadamente 1 día y se completa con agua destilada. Envasar en frasco color caramelo, reposar 1 mes y filtrar para su uso.
2 – Solución de Lugol
Yodo: 5 g.
Yoduro de potasio: 10 g. (agregar un exceso, aprox.1g. para disolver el yodo)
Agua dest.: 1000 ml.
En botella color caramelo: poner el IK, previamente disuelto en 100 ml. de agua dest., al que se agrega los 5 g. de yodo. Agitar para disolver el yodo. Completar a 1000 ml. con agua destilada. Tapar la botella y agitar.
3 – Decolorante
Alcohol de 96C: 80 ml.
Acetona: 20 ml.
4 - Fucsina
Fucsina básica: 10 g.
Alcohol de 96°: 100 ml.
Fenol 95%: 10 ml.
Agua dest. CSP 1000 ml.
En botella color caramelo: Fucsina básica + 100 ml. de alcohol de 96°+ 10 ml. de fenol. Dejar 48 hs. en estufa a 37°C y se lleva a 1000 ml. con agua destilada. Dejar decantar 1 mes. Filtrar al usar.
MÉTODO:
Extender, secar y fijar al calor.
Cubrir la preparación con Violeta de Genciana y dejar actuar 1 minuto.
Lavar con agua.
Cubrir con Lugol 1 minuto.
Lavar con agua.
Decolorar con alcohol-acetona con cuidado hasta que arrastre el colorante
( las partes más finas del extendido quedan incoloras).
Lavar con agua.
Cubrir con fucsina diluída al décimo durante 30 segundos.
Bacterias grampositivas: se tiñen de color violeta.
Bacterias gramnegativas: se tiñen de color rosado.
Examen del extendido coloreado por el Gram
Con poco aumento se evaluará la conveniencia de la muestra.
Cuando se buscan bacterias se usa la lente de inmersión en aceite (x1000).
Para evaluar la conveniencia técnica de la coloración se utiliza la lente de inmersión.
Se observará la calidad del extendido. Preparados demasiado concentrados (“frotis gruesos”), conducen a errores de interpretación.
Excesiva fijación por el calor, puede alterar la morfología normal de las bacterias y las células.
La decoloración escasa o excesiva, puede dar variaciones en el resultado de la coloración.
Es de importancia, sobre todo al cambiar insumos, realizar sistemáticamente controles, utilizando cepas bacterianas perfectamente identificadas.
COLORACION DE GIEMSA
Reactivos:
Metanol
Colorante de Giemsa.
Agua tamponada pH 7,2
Técnica:
Extender y secar a temp. ambiente.
Fijar con metanol 3 minutos.
Cubrir la preparación con una dilución acuosa de Giemsa en agua destilada
neutra (1 gota de colorante por ml. de agua destilada)
Dejar actuar 15 minutos. (La coloración de Giemsa prolongado dura 45-60 min.)
Lavar con agua.
Secar y observar con objetivo de inmersión.
El colorante de Giemsa es una solución en alcohol metílico y glicerina, de eosina, azul de metileno y azur II.
ANEXO 3
En la tabla que sigue se presenta el diagrama de la metodología propuesta por Nugent.
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE NUGENT
Valor numérico
que se otorga
por campo |
Lactobacilos |
GARDNERELLA/ BACTEROIDES.
Bacilos cortos Gram variables |
Bastones Gram Negativos
(CURVOS) |
| 0 |
4+ |
0 |
0 |
1 |
3+ |
1+ |
1+ 0 2+ |
2 |
2+ |
2+ |
3+ 0 4+ |
3 |
1+ |
3+ |
|
4 |
0 |
4+ |
|
El valor numerico se asigna teniendo en cuenta la proporción relativa de tres criterios morfológicos:
*Morfotipo lactobacilos
*Morfotipo de Bacteriodes (pequeños bastones), Gram variables (Compatibles con Gardnerelas
y anaerobios.
*Morfotipo de bacilos Gram negativos, curvos.
Como puede observarse en el valor asignado a cada uno de estos tres “paquetes” morfológicos, el de los bacilos Gram negativos curvos, tiene menor peso que los otros dos.
En la práctica uno debe referir a la LECTURA DE UN NÚMERO DE CAMPOS MICROSCÓPICOS, leido con el aumento máximo con objetivo de inmersión.
Las “cruces” /+) en cada caso se asignan de acuerdo a la siguiente interpretación de la lectura de cada campo microscopico:
| Cero(0) |
Ausencia del morfotipo que se evalúa |
| Una (1+) |
Un morfotipo o ninguno por campo |
| Dos (2+) |
Un morfotipo a cuatro |
| Tres (3*) |
Entre cinco a treinta morfotipos por campo |
| Cuatro (4+) |
Treinta o más morfotipos presentes. |
Al momento de realizar el estudio el operador puede documentar sus resultados utilizando indistintamente el sistema de cruces o directamente el número de morfotipos por campo, esta última forma es la recomendada por el Manual del Curso a Distancia de la Asociación Argentina de Microbiología (pag 92). Para lo que puede manejarse el siguiente esquema:
INTERPRETACIÓN DE LA COLORACIÓN DE GRAM DEL
CONTENIDO VAGINAL SEGÚN EL CRITERIO DE NUGENT
| Morfotipos en la coloracióm
de Gram |
Valor numérico
(nº elementos/campo) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
Lactobacillus spp
|
>30 |
5-30 |
1-4 |
<1 |
0 |
| Cocobacilos gram-negativos tipo anaerobio ó Gardnerella
|
0 |
<1 |
1-4 |
5-30 |
>30 |
| Bacilos gram-negativos curvos compatibles con Mobiluncus
spp. |
0 |
1-4 |
5->30 |
- |
- |
ANEXO 4
A continuacion se introduce un modelo de planilla de apoyo para la
documentación de la lectura del Gram.
BACOVA (apoyo a la lectura del Gram. Puede ser utilizado en las otras
lecturas)
Método de lectura
microscópica.
a. Verificar la correcta coloración con controles
apropiados.
b. Verificar la homogeneidad de los extendidos a observar.
c. Señalar en forma imaginaria cuatro cuadrantes
del preparado y observar dos campos por cuadrante y dos más
a elección. Así se completa la primera lectura
de 10 campos perfectamente observados y documentados.
d. Si se obtiene una clara definición ( de 1-3 o
de 7 a 10, incluyendo corrección células guía)
, se da por terminado el estudio numérico. Si se encuentra
en zona de 4 a 6 (con corrección de células
guía incluido) , se procede a la lectura, en otro extendido
diferente, de ocho campos, siguiendo el mismo procedimiento
anterior.
e. Se analizan los resultados de ambas lecturas y si persiste
el resultado intermedio, se informará, aclarando la
presencia o no de células guía. |
Anexo 5
Morfotipos Extraños
Con una frecuencia que oscila alrededor del 25 % en mujeres embarazadas sintomáticas, analizando la coloración de Gram,
se observan además de los morfotipos de la microbiota habitual, bacterias que no integran la imagen normal del contenido vaginal.
La visualización con aumento de 1000X indica de hecho un sobre crecimiento anormal de estas especies, que no puede asignarse
per se a un papel patológico (infección) o a una mera colonización favorecida por los cambios generados por la disfunción de las mucosas vaginales.
Es imposible asignar a este criterio un valor predictivo sobre etiología de DV.
Como en el caso de TV, la presencia de morfotipos compatibles
con Neisseria gonorroheae, deben ser informados por su nombre específico, alertando sobre dicha posibilidad , aun en ausencia de respuesta inflamatoria. Es frecuente en mujeres que la colonización con gono sea asintomática.
La presencia de morfotipos extraños en el contenido vaginal, no conduce a establecer un diagnóstico que condicione un tratamiento específico.
La importancia de su detección esta asociada al entorno de todos
los otros criterios que aporta BACOVA Si la mujer presenta desbalance de la microbiota: VN de 4 o más y RIV significativa,
el informe de morfotipos extraños significará un criterio de valor
para considerar una VMI y orientar en la decisión inmediata,
sobre que estudio de laboratorio especializado se requiere.
Por ahora recomendamos en este manual informar Mex, agrupados en cuatro modelos:
a.- Cocos y bacilos Gram positivos
b.- Bacilos Gram Negativos (enterobacterias)
c.- Corineformes
d.- Actinoformes
Tampoco agregar ninguna evaluación cuantitativa. Se trabaja
en la formulación de una evaluación para establecer un valor numérico relacionado con otro criterio de fácil cuantificación.
En la actualidad se trabaja intensamente en el refinamiento
del VN (Nugent como gold Standard) en función de una mejor definición de los Mex.
Anexo 6
Reacción Inflamatoria Vaginal y Células guía
Las CG representan un criterio de alto valor predictivo y su identificación contribuye a aumentar el valor predictivo positivo
y negativo de la VB.
La publicación original de Amsel y otras incorporan un factor cuantitativo (más de 20% de las células epiteliales por campo),
lo cual es realmente opinable. En BACOVA hemos tomado el estudio original de Lanzafame, como monitor. En su comunicación también habla de más de una célula.
La interpretación actual es que el desbalance de la microbiota, derivado sin dudas de una disfunción de la mucosa del tracto genital bajo, favorece como hecho temprano un cambio en la adherencia
de bacterias a las células, realmente típico de lo que llamamos VB.
Donders dice que en la Vaginitis Aeróbica, a la que nosotros llamamos con más propiedad VMI, las CG no están presentes
y la DV se orienta a una respuesta inflamatoria significativa.
Todo el trabajo de lectura microscópica es de igual importancia,
pero la búsqueda y la perfecta identificación de CG, es una llave
con gran valor agregado en el diagnóstico de la DV.
Tanto en fresco, Gram, Giemsa, es posible encontrar CG típicas
y afinar la observación ya que pueden presentarse células morfológicamente compatibles con CG, pero que las bacterias adheridas son “lactobacilos” y no las características formas “gardnerela formes”. Tambien pueden presentarse celulas alteradas en morfología (vacuoladas, bordes indefinidos), que no presentan bacterias adheridas, pero que potencialmente deben ser consideradas como CG.
Recuento de Leucocitos en el Contenido Vaginal.
Recientemente se ha confirmado la importancia de la determinación de leucocitos por campo, como criterio para inferir la RIV y su introducción en el diagnóstico diferencial de VB, VMI y otras DV.
Existen normatizadas dos variantes:
a.- Leucocitos por campo en coloración de Gram, con 1000X de aumento.
b.- Leucocitos por célula epitelial por campo. Lectura con 400X. Esta debe ser monitoreada en la observación en fresco y del Gram, pero debe ser confirmada escrupulosamente en la lectura de la coloración de Giemsa.
En el Manual de Procedimientos BACOVA 2006/7 hemos adoptado las dos variantes, dando prioridad a la primera, (que es la más común ) integrante de el Manual de Procedimientos desde 2004 y en función de un resultado que supere la línea de corte de 5 Leucocitos por campo, se debe realizar el recuento en función de las células epiteliales, confirmado fehacientemente, como antes se ha mencionado, en el preparado teñido con Giemsa.
Anexo 7
Levaduras
En el caso de la vulbo vaginitis por levaduras (VVL), el estado inflamatorio agudo está asociado a levaduras propias de la microbiota habitual. La disfunción a nivel de la estructura vaginal también es generada por cambios sistémicos que condicionan la acción patógena oportunista de las levaduras .
En este caso los factores mediadores son distintos de los que inducen el desequilibrio primario de la microbiota del contenido vaginal (VB)
y las que completan la etapa evolutiva a VMI. En el caso de VVL típica, el pH es normal y el balance de lactobacilos y la microbiota anaeróbica también se mantiene normal.
La presencia de levaduras es de detección microscópica simple, inclusive en ciertos casos pueden describirse etapas reproductivas
y dimorfismo (formación de hifas), lo que tradicionalmente lo asocia con levaduras “activas” en el diagnóstico de VVL.
El problema es que la presencia microscópica y/o detectadas por cultivo de levaduras en el CV, que alcanza no menos del 20% de todas las mujeres examinadas, no es sinónimo suficiente de vulvovaginitis .
Otros criterios deben ser tenidos en cuenta, para darle significación patológica a la sola presencia microscópica en el CV. El equilibrio de la microbiopta vaginal puede variar, pero hay una tendencia de la VVL típica, a desarrollarse en mujeres con contendido vaginal equilibrado (presencia normal de lactobacilos). Basados solamente en la detección microscópica, la RIV es el indicador mas importante para diferenciar la colonización pasiva por Levaduras (de alta prevalencia en mujeres sanas) a el daño sobre las estructuras tisulares vulvovaginales, asociado necesariamente a desequilibrios sistémicos inmumo hormonales de la mujer.
COMENTARIOS SOBRE EL MANUAL
de PROCEDIMIENTOS BACOVA
Propuesta de Protocolos de validadción.
La RIV constituye la columna vertebral en la interpretación de la DV y en el manejo del riesgo gineco obstétrico. Hemos iniciado un programa ampliatorio de BACOVA, específicamente dirigido a la optimización de la capacidad de respuesta del Bioquímico en general, en la identificación de la RIV.
ERIGE (Estudio de la Respuesta Inflamatoria Genital)
El Taller ERIGE, que dirige el Prof. Dr. Luis Palaoro, se encuentra en pleno desarrollo y similar a BACOVA, está abierto a todo profesional interesado. Para comunicarse utilizar: proeco.erige@fba.org.ar
Validez de BACOVA en función de la edad de la mujer.
Uno de los problemas de mayor incertidumbre en la interpretación del VN de BACOVA para VB es la falta de experiencia documentada sobre la evolución de la microbiota vaginal en función del período de perimenopausia/menopausia en nuestro medio.
Hemos iniciado un estudio para intentar establecer parámetros que definan el valor predictivo de BACOVA en la DV en la etapa final de los ciclos ovulatorios.
Nuevamente invitamos a todo aquel interesado en aportar casos
a este estudio a tomar contacto con preoco.bacova@fba.org.ar
Recordamos nuevamente que la inscripción en el Taller Participativo Nominal electrónico BACOVA y/o ERIGE, es no arancelada, las actividades se pueden comenzar en cualquier época del año (exceptuando enero) y para mayores datos se puede recurrir a la pagina de internet de la Fundación Bioquímica Argentina.
