| Manual de Procedimientos:
Balance del Contenido Vaginal (BACOVA 2009)
Vigente desde el 1 de ENERO al 31 de DICIEMBRE 2009
Cuadro de SituaciónA principios del 2008 el Consejo de Administración de la Fundación Bioquímica Argentina (FBA) creó el Programa de Salud Sexual y Reproductiva (PROSAR). Los cursos convencionales sobre temas vinculados a salud sexual y reproductiva, siguen organizados y ejecutados en el marco del PROECO. La actividad específica que desarrolla PROSAR, es la creación de Agencias Regionales, en todo el país. La prioridad es el desarrollo de Talleres Participativos Nominales (aprendizaje entre pares), para la optimización de prestaciones realizables en forma individual por el bioquímico, en todos los laboratorios habilitados del país, cualquiera sea el grado de complejidad estructural. Los Talleres Participativos Nominales (no arancelados) del proyecto Balance del Contenido Vaginal (BACOVA) se desarrollan en el marco de PROSAR. En virtud de estas variables de organización, se decidió transferir la renovación anual tradicional del Manual de Procedimientos BCOVA, que vencía en el mes de agosto de 2008, a esta versión actualizada en el mes de enero y vigente hasta el 3l de diciembre de 2009. Aspectos de importancia concretados en el 2008 a.- CONSENSO BIOMÉDICO PARA VALIDACIÓN DE BACOVA b.- INCORPORACIÓN DE BACOVA AL NOMENCLADOR BIOQUÍMICO UNICO (NBU) DE CUBRA c.- TALLER BACOVA, XIII JORNADAS ARGENTINASDE MICROBIOLOGÓA, ROSARIO 2008. a.- CONSENSO BIOMÉDICO PARA VALIDACIÓN DE BACOVA La Federación Argentina de Sociedades de Ginecología y Obstetricia (FASGO), La Fundación Bioquímica Argentina (FBA), el Instituto de Fisiopatología y Bioquímica Clínica (INFIBIOC-UBA), la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA), junto con grupos de Unidades Académicas de enseñanza de la Bioquímica del País (estatales y privadas), Instituciones de atención primaria del sector Público y Privado, han participado en la confección de la guía practica de procedimientos para atención de la Disfunción Vaginal (vaginosis-vaginitis, en la mujer en edad fértil, que incorpora BACOVA, como metodología de base diagnóstica (1). La guía ha sido publicada en la revista oficial FASGO CIENCIA, 2008 Vol 7 (Nº1) paginas 43-51 y puede consultarse además en la pagina de internet de FASGO (www.fasgo.org.ar/consensos) y en la página de internet de la FBA (www.fba.org.ar/proeco ), además en varias páginas de internet que han incorporado el “link” respectivo. En el caso de que usted quiera tener una versión electrónica puede solicitarla a: bacova204@yahoo.com.ar b.- INCORPORACIÓN DE BACOVA AL NOMENCLADOR BIOQUÍMICO UNICO DE CUBRA A fines del 2008 y luego de reuniones de discusión técnica y basado en el reconocimiento de la comunidad científica biomédica especializada se incorporó al NBU la prestación BACOVA. De acuerdo a la reglamentación del nomenclador, la incorporación se ha efectuado de la siguiente manera: Vaginal, Balance del Contenido (BACOVA) Se le ha asignado un indicador de conversión de seis puntos. c.-TALLER BACOVA XIII JORNADAS ARGENTINASDE MICROBIOLOGÓA ROSARIO 2008. La base del documento actual, incorporando conclusiones consensuadas en muchas actividades presenciales desarrolladas en varias regiones del país en el 2008, se concretó en la reunión del Taller BACOVA que se llevó a cabo en las XIII Jornadas Argentinas de Microbiología en Rosario el 11 de octubre 2008. El Taller fue coordinado por las Dras. Mónica NOGUERAS (Rosario), Adriana María BELMONTE (Rosario) y Liliana ROLDAN (Santa Fé) Los trabajos presentados en el Taller, se pueden consultar en la página de la FBA y/o pueden obtenerse solicitándolos a bacova2004@yahoo.com.ar En la tarde del día 11, en el marco de la Cátedra de Microbiología de la Facultad de Odontología (Universidad Nacional de Rosario), se llevó a cabo una reunión anexa, bajo la coordinación de la Profa. Dra. Emma SUTICH (Rosario), en la que participaron integrantes deAgencias del programa PROSAR, de varios lugares del país. Las conclusiones de esta reunión y la consideración de todas las propuestas de pares recibidas hasta el 15 de diciembre de 2008, generan la versión actual del Manual de Procedimientos BACOVA 2009. De hecho todo interesado en emitir críticas, opiniones y/o propuestas, las mismas se reciben también en el correo directo del proyecto: bacova2004@yahoo.com.ar Características de la actualización 2009. De acuerdo a la modalidad de trabajo del PROSAR, aprendizaje entre pares con el objetivo de la optimización de prestaciones de realización personal, se han tenido en cuenta un número importante de opiniones. En general se focalizan en pocos problemas puntuales, obviamente de difícil solución y permanente evaluación. Las modificaciones introducidas en esta versión, son referidas principalmente a los temas de toma de muestra, informe de levaduras y células no habituales y una propuesta para el aumento de la sensibilidad en la detección de tricomonas. La versión 2009 tiende al formato convencional de un manual de procedimientos típico. La difusión de publicaciones institucionales oficiales y la presentación en reuniones científicas y publicación de trabajos de investigación validando BACOVA, avalan la reducción del texto original. Se han eliminado consideraciones anexas presentes en las versiones 2004 a 208. Estas versiones están a disposición de todo interesado. Es muy importante volver a estudiar integral y críticamente la versión 2009, sobre todo en base al aumento significativo de la utilización de BACOVA, lo que permite al bioquímico el análisis crítico del trabajo diario, enfrentando la importante cantidad de variables que se presentan según las condiciones de atención primaria, en distintos laboratorios. Agregamos lecturas básicas y recomendamos especialmente la información de apoyo a la Guía Practica (5,8) en el que se discuten variables críticas, con un enfoque clínica/laboratorio. La mayoría de las referencias se encuentran en la página de Internet de la FBA. Todas pueden ser solicitadas al programa para obtener envío por vía electrónica o correo convencional. Llamamos la atención especial sobre el emprendimiento de PROSAR: Proyectos de validación de BACOVA (item 7) Se promueve la participación de bioquímicos interesados, en base al análisis de resultados propios, realizados en y abierto a todo laboratorio habilitado del país. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACOVA 2009 ÏNDICE 1.-Población a la que está dirigido el estudio. Solicitud de la prestación BACOVA 2.-Toma y Transporte de la muestra 3.-Proceso de laboratorio 4.-Secuencia de Trabajo recomendada. 5.-Informe de los resultados 6.-Anexos 6.1.-Coloraciones 6.2.-Determinación del Valor Numérico 6.3.-Planillas de apoyo 6.4.-Informe a la paciente. 6.5.-Problema de la determinación del pH vaginal. 7.-Proyectos de validación 8.-Lectura recomendada Abreviaturas CG Células Guía DV Disfunción Vaginal FTM Ficha de toma de muestra Le Levaduras Mex Morfotipos extraños RIV Respuesta inflamatoria Vaginal SF Solución fisiológica TV Tricomonas VB Vaginosis Bacteriana VMI Vaginitis Microbiana Inespecífica VN Valor Numérico DESARROLLO Alcance actual de BACOVA 2009. BACOVA es el estudio morfológico integral del contenido vaginal en todos sus aspectos biológicos. Con el análisis conjunto del VN y RIV se genera un informe predictivo (no descriptivo), para el diagnóstico de las patologías de mayor frecuencia en la disfunción vaginal de la mujer en edad fértil. Con el 100% de valor predictivo positivo y negativo, determina el diagnóstico diferencial del estado normal del contenido vaginal, vaginosis bacteriana y vaginitis microbiana inespecífica. Con valores de 60-70% de valor predictivo positivo (valor predictivo negativo muy bajo) informa sobre la presencia de levaduras y/o tricomonas. Contribuye como alerta de gran importancia clínica, en caso de la detección de morfotipos bacterianos extraños y/o células epiteliales no habituales en el contenido vaginal. (1-3,5,8) 1.-Población a la que está dirigido el estudio. Solicitud de la prestación BACOVA Población El informe BACOVA está validado para el estudio de toda mujer en edad fértil (pos menarca y premenopáusica), embarazada o no. Sintomática o asintomática. Criterios de exclusión El VN no esta validado en la atención de prepúberes. No está validado el Valor Numérico en las mujeres perimenopáucicas, menopáusicas y/o bajo tratamiento hormonal de reemplazo. En el año 2008 se han completado estudios sobre la aplicación de BACOVA en mujeres menopáusicas. Estos resultados serán evaluados en el curso del año 2009, pero recomendamos la lectura y análisis del trabajo completado por la Especialista en Bacteriología Clínica (FFyB-UBA) Bioquímica Marcela Nastro (6). Además Ver 7.0 Proyectos de Validación. BACOVA no tiene valores predictivos válidos en muestras tomadas entre los tres días previos y hasta cinco días después de la menstruación y en casos de hemorragia del tracto urogenital. Solicitud del Estudio La prestación está nomenclada en el NBU, como Vaginal, Balance del Contenido BACOVA. La solicitud correcta que se instrumenta es Balance del Contenido Vaginal y en forma simplificada :BACOVA. 2.-Toma y Transporte de la muestra. En todos los casos la mujer debe prestar consentimiento informado para la realización del estudio y toma de la muestra. En forma ideal debe recibir las instrucciones escritas al momento de la solicitud del estudio en el área clínica, donde en muchos casos se obtiene la muestra. En el caso de ser derivada al laboratorio con la solicitud respectiva de estudio, se procederá a confirmar el consentimiento de la paciente. En todos los casos se deberá evaluar la posible toma inmediata de la muestra o en su detecto entregar las instrucciones, completando toda aclaración que resultara necesaria. En todos los casos, la muestra, al ingresar al área de proceso, debe ir acompañada de la siguiente ficha de toma de muestra (FTM) que debe ser completada por el profesional responsable de la toma directa:
Bioseguridad Se asegurará que todas las exigencias de bioseguridad estén controladas en todo el proceso de toma, transporte y proceso de la muestra. 2.1.- Variables más frecuentes relacionadas con la recepción de la muestra en el área de laboratorio de proceso. La experiencia adquirida en los talleres BACOVA, muestra que la toma y transporte de muestra es la etapa de la prestación sujeta a la mayor cantidad de variables de muy difícil control. La política actual es la de promover el mayor esfuerzo para el cumplimiento de las condiciones ideales y participar en la promoción activa de la difusión de las normas básicas a todo el grupo biomédico. Fundamentado en la Guía Practica de consenso (1) Ante la dispersión de factores, lo ineludible es documentar en el informe final las variables asociadas a la muestra en estudio y/o dejar constancia del desconocimiento de las condiciones reales de la toma. Obviamente estas condiciones deben ser documentadas en los informes, para garantizar una correcta interpretación y convocar la atención del grupo médico responsable de la toma a estandarizar al máximo el procedimiento. En función de la realidad diaria observada, que muestra un significativo número de casos en los que no se da cumplimiento integral de las condiciones ideales, se ha desarrollado un programa de proyectos de validación, que ajusten los valores preedictivos de BACOVA, para las condiciones especiales más frecuentes en la toma de la muestra (Item 7). Hemos avanzado en el estudio de variables y en el análisis de la experiencia internacional, en general, los resultados referentes a VN son mucho más estables a las condiciones no ideales de toma y transporte de la muestra exigidas en la actualidad por BACOVA. Los valores de RIV sufren dispersión e inseguridad con facilidad. De hecho debe tenderse al cumplimiento integral de las recomendaciones básicas y completar los estudios necesarios para validar variables “menores” que se presentan con mayor frecuencia. 2.1.1.-Procedimiento ideal Consideramos algunas de las variables mas frecuentes que permiten condiciones ideales de toma de muestra. Mujer que concurre al área de laboratorio con la orden médica. Se debe evaluar siempre, la posibilidad de tomar la muestra en forma inmediata o en su defecto concretar el turno respectivo en el plazo más breve, en la seguridad del estricto cumplimiento de las indicaciones ideales básicas. En ambos casos se debe informar a la mujer sobre el procedimiento y obtener su consentimiento. Asegurar el nivel de comprensión necesario. En el caso de que la paciente cumpla con las condiciones básicas, completar la FTM respectiva y obtener la muestra en el momento. En caso de no cumplirse las condiciones básicas ideales y no mediando un factor de urgencia clínica, condiciones de traslado u otras, que lo justifiquen, se otorgará un turno a la mujer, apoyado en la indicación escrita y las recomendaciones necesarias para obtener una muestra segura en el plazo que se fije. En el caso de que alguna de las condiciones ideales no se cumpla y de considerar prioritaria la variable de urgencia, se dejará expresa constancia en el informe correspondiente sobre las condiciones no ideales al momento de la toma de muestra. Esta situación debe ser documentada en el informe de laboratorio y evaluado en forma puntual por el médico al interpretar el resultado obtenido. El estado menstrual es de exclusión absoluta. En condiciones particulares, la influencia de un eventual tratamiento a que este sometida (controles de seguimiento) debe finalmente ser evaluado por el médico. La actividad sexual previa. En el caso de la no utilización de preservativo, se considera que la modificación manifiesta es el cambio transitorio del pH del contenido vaginal , factor no considerado en el informe BACOVA. La toma de muestra en condiciones en la que no se puede utilizar espéculo, tampoco es excluyente y si se debe dejar constancia en el informe (ver más adelante). Reiteramos la necesidad de estar informados sobre los proyectos de validación. (Item 7). 2.1.2.- Otras situaciones frecuentes a considerar. 2.1.2.1.- Mujer que concurre al área de laboratorio con la muestra tomada en el ámbito de la consulta médica. Existen en principio dos variables. Pacientes provenientes de áreas clínicas con las cuales esta normatizado el sistema de solicitud de BACOVA y FTM, en la que se está en la situación antes analizada y aquella en la que no hay ningún consenso previo con el área clínica. En ambos casos la presencia de la paciente, permite reiterar el consentimiento informado y verificar si se cumplen las exigencias básicas en la FTM completada en origen o al completar la misma en el caso de no haber sido considerada al tomarla. Evaluar las variables que no se cumplen, que no justifican el rechazo de la muestra, dejando expresa constancia de las mismas en el informe respectivo. En el caso de falta de contacto previo con el solicitante, agregar anexo al informe, copias de la solicitud de BACOVA y de la FTM al grupo clínico. Se hace notar que la vigencia de la Guía Practica (1), asegura la posibilidad y necesidad de tomar contacto con los grupos de atención médica a los efectos de promover el cumplimiento de las indicaciones consensuadas. 2.1.2.2.- Muestra que llega al área de laboratorio, transportada por terceros, tomada en el área de asistencia médica. Verificar la FTM. Si la muestra procede de un grupo con el que no hay acuerdos previos sobre la toma y envío de muestras para BACOVA, llenar la FTM, con los datos que se dispongan, dejar expresa constancia en el informe y agregar adjunto los modelos de fichas de trabajo. 2.1.3.- Situaciones puntuales. 2.1.3.1.-Muestra enviada en medio de transporte Stuart. En general son muestras sobre las que existe una indicación de cultivos bacterianos, en las que generalmente se cumplen las condiciones exigidas para BACOVA. Pero deben verificarse las variables antes expresadas en base a la FTM. Verificar ( si existe) y/o llenar la FTM (en caso de no haber sido completada) y realizar el estudio BACOVA, de acuerdo a lo ya normatizado en el Manual 2007/2008. En la actualidad el trabajo correspondiente validando BACOVA, en muestras transportadas en Stuart se encuentra publicado (4). Se recuerda que el VN está validado y que la RIV debe ser establecida exclusivamente poir el recuento de leucocitos por célula epitelial por campo microscópico. 2.1.3.1.-Imposibilidad de utilizar espéculo. En este caso se debe recurrir a la toma de muestra “a ciegas”. Separando manualmente los grandes labios e introduciendo el hisopo respectivo en el tracto vaginal, rotándolo , controlando en forma permanente el no causar dolor y regulando la mayor profundidad posible alcanzada naturalmente, evitando presionar. Los valores obtenidos son válidos para el VN, pero no están validados para la RIV, ya que el componente relativo de células epiteliales varía en muestras tomadas desde el fondo de saco y sectores más cercanos a la parte externa vaginal. El informe debe consignar la condición especial de toma de muestra. 2.2.- Descripción técnica de la toma de muestra de fondo de saco vaginal para BACOVA 2.2.1.-Material necesario Guantes, Hisopos, Espéculo, Tubo de ensayo seco,Tubo de ensayo contenido 0.5 ml de Solución Fisiológica estéril. 2.2.2.- Procedimiento 2.2.2.1.-Toma de la muestra estándar utilizando espéculo. El hisopo a utilizar no requiere características especiales y debe ser estéril tan solo para garantizar la bioseguridad a la paciente. Es de fundamental importancia la estandarización del tipo de hisopo a usar, de forma de asegurar uniformidad para todos los estudios y manteniendo la misma cantidad y moldeado del algodón hidrófilo utilizado. El mango puede ser de madera, plástico o metálico. Se utilizarán dos hisopos por toma. Se colocará a la paciente en posición ginecológica y una vez introducido correctamente el espéculo, con suficiente iluminación, se localizará la posición del cuello de útero y se verificará la posibilidad de acceso directo al espacio virtual existente por debajo del mismo o fondo de saco vaginal. Se procederá a introducir el hisopo y tomar con movimientos rotatorios (sin presionar sobre las mucosas vaginales), material de la secreción acumulada en ese sitio. Se debe evitar tocar las paredes del espéculo o la región externa vaginal al retirar el hisopo. Aun en condiciones de un escaso volumen líquido acumulado en el fondo de saco, debe evitarse el “raspado” de la mucosa vaginal. Una vez tomada la primera muestra, el hisopo se introduce el tubo seco. Se hace una segunda toma de fondo de saco y se introduce en el tubo que contiene 0.5 ml de solución Fisiológica (SF) estéril. 2.2.2.2.- Transporte de la muestra Se verifica que el rótulo exterior de los tubos coincida con los datos de identificación fehaciente de la FTM de la paciente en estudio y se envía al área de proceso de laboratorio. El traslado ideal debe ser inmediato. La experiencia indica que en la mayoría de los casos el espacio de tiempo y las condiciones de manejo de la muestra, entre la toma y el acceso al proceso de laboratorio varía en forma significativa. La muestra debe ser conservada a temperatura ambiente (20 +/- 5 grados) evitando el enfriamiento o que sea calentada. Lo ideal es procesar la muestra destinada al estudio en fresco (hisopo en tubo con 0.5 ml de SF), en el plazo no mayor de una hora a partir de obtenida. La realización de los extendidos destinados a las coloraciones de Gram y Giemsa, también se ven beneficiados si se realizan en el plazo de una a dos horas. El ideal es el proceso inmediato y muy aceptable hasta dos horas después de la toma. Existen muchas variantes que han sido ensayadas para diferentes criterios analíticos, como por ejemplo el VN, que acepta distintos manejos de la muestra, pero que ho han sido validados para la RIV. Para el estudio morfológico integral de BACOVA, por ahora no se puede exceder el marco que se acaba de definir como ideal, tratando en todos los casos, manejar la toma de la muestra en el área de laboratorio. 3.-Proceso de laboratorio. 3.1.- Preparación del material para el estudio morfológico integral. 3.1.1.- Preparación para examen en fresco. Se trabaja con el hisopo que se encuentra en el tubo con 0.5 ml de solución fisiológica estéril. Homogeneizar manualmente, tratando de transferir la mayor cantidad de material a la fase líquida. Colocar “gotas” de la suspensión entre porta y cubreobjetos para la observación en fresco. Esta etapa requiere el mayor esfuerzo operativo para que la preparación y lectura microscópica se realicen lo antes posible, lo que aumenta la sensibilidad del diagnostico de TV y bacterias móviles y asegura estabilidad de la morfología celular. 3.1.2.- Preparación de extendidos para la tinción de Gram Utilizando el hisopo sin agregado de SF, se hacen extendidos en portaobjetos desengrasados, limpios y secos, generando una capa fina. Se fija por calor y se procede a la tinción de Gram (anexo 6.1). 3.1.3.- Preparación de extendidos para la tinción de Giemsa Se utiliza el mismo hisopo usado para la coloración de Gram. El extendido requiere un proceso de fijación distinto y crítico. (Anexo 6.1). Es siempre recomendable realizar los extendidos en forma inmediata a la recepción de la muestra, en forma simultánea a la realización de la preparación en fresco. La realización de las tinciones (post fijación) permiten un espacio de tiempo en el que se puede completar la lectura del preparado en fresco. 4.-Secuencia de Trabajo recomendada. 4.1.- Examen en fresco. Se recomienda iniciar la lectura con aumento de 400X, para tener la imagen global y verificar la validez de la muestra tomada. Se deberán hacer anotaciones ordenadas y precisas ( anexo 6.3). El examen en fresco tiene un gran valor agregado y ante la imposibilidad de disponer de coloraciones accesorias, sistematizando y profundizando el análisis adquiere un alto nivel predictivo. En el caso de servicios habilitados el estudio microscópoco del contenido vaginal en fresco, durante el examen clínico de la paciente, ofrece ventajas de gran valor operativo (1). Se debe concentrar el estudio sobre los siguientes criterios: a.- Apreciación global de la relación de lactobacilos y resto de la microbiota habitual, generando un VN preliminar de apreciación subjetiva, que oriente a ubicar el preparado en una de las tres categorías numéricas, de 0 a 3/ 4 a 6/ 7 a 10. Este resultado será verificado luego mediante el recuento relativo estandarizado en el Gram. b.- Detección de bacterias móviles compatibles con Mobiluncus c.- Presencia de levaduras. d.- Presencia de Tricomonas. e.- Apreciación global preliminar subjetiva, de la relación de Leucocitos por campo y Leucocitos por Célula Epitelial por campo microscópico, con aumento de 400X. Generar una cifra de aproximación que va a ser nuevamente evaluada al leer la coloración de Gram y finalmente confirmada por un minucioso estudio en el Giemsa, en el caso de ser necesario. f.- Detección de morfotipos bacterianos extraños. g.-Prolija evaluación de la presencia de células guía y células “redondas” o francamente distintas de aquellas epiteliales típicas, de presencia habitual en el contenido vaginal normal. h.- Toda otra evidencia anormal que se detecte. 4.2.-Lectura del Gram. El extendido teñido con la coloración de Gram brinda tres criterios fundamentales prioritarios. Establecer el VN, informar sobre morfotipos no habituales en la vagina y la información sobre RIV. 4.2.1.-Lectura del Gram para generar el informe de valor numérico (VN) . Se establece con seguridad el VN de 1 a 10 de acuerdo al estudio de los morfotipos de la microbiota habitual vaginal (anexo 6.2) 4.2.2.- Lectura del Gram para generar el informe sobre Morfotipos Extraños (Mex) Analizar la presencia de Mex, es decir formas bacterianas diferentes de las epecies de la microbiota habitual. Utilizar en forma combinada el juego de aumentos de 400X y 1000X para tener una visión global de la distribución relativa y una aproximación sobre el o los morfotipos presentes. Por el momento los Mex se sistematizan en cuatro grupos: cocos y/o bacilos Gram positivos, bacilos Gram negativos (compatibles con enterobacterias), corineformes y formas compatibles con Actinomyces. Por el momento se obvia informar “cantidad”, ya que no genera ningún aumento del valor predictivo. Hay en desarrollo, a nivel internacional, estudios sobre el “refinamiento” del estudio de morfotipos bacterianos en el contenido vaginal, que se encuentran en etapa de estudios de validación (Item 7) 4.2.3.-Lectura del Gram para establecer el Número de Leucocitos por campo (Lpc) con aumento de 1000X. Con una clara visión panorámica previa (400X) de la calidad del preparado, se eligen las zonas más apropiadas (frotis homogeneo) y luego, con aumento de 1000X, se procede a la evaluación cuantitativa de Lpc. Se deberán analizar no menos de cinco campos, no adyacentes. De obtenerse valores de dispersión racionales, se calcula e informa un solo número entero. Si es necesario se realizará el estudio de otros cinco campos más. En el caso de obtenerse una cifra igual o de más de cinco Lpc, se deberá completar el recuento de Leucocitos por célula epitelial por campo, en el extendido teñido con Giemsa, utilizando un aumento de 400X. El valor de corte en este caso es que uno o más de un leucocito por célula epitelial por campo significa RIV significativa. 4.3.- Lectura de la coloración de Giemsa. Se manejan dos criterios analíticos separables. El primero para una revisión general confirmatoria de resultados previos (Fresco y Gram) y búsqueda avanzada y el otro cuando necesario, incluye la evaluación cuantitativa definitiva de la RIV determinando el número de Leucocitos por célula epitelial por campo. 4.3.1.-Etapa confirmatoria y búsqueda avanzada. Esta etapa del proceso significa: a.- Verificar o detectar la presencia o no de Tricomonas. b.- Verificar o detectar la presencia o no de Levaduras. c.- Verificar la impresión sobre presencia de morfoipos extraños. d.- Confirmar o detectar CG e.- Confirmar la racionalidad del VN aproximado por la lectura del fresco y determinado por el estudio en el Gram. f.- Confirmar o detectar la presencia de células epiteliales no habituales del contenido vaginal. Células redondas en general. 4.3.2.-Valor de la relación de leucocitos por célula epitelial por campo. En el caso de tener un número de Leucocitos por campo de 10 o más (400X) en el fresco o de 5 o más, en el estudio de la coloración de Gram (1000X), se procederá a la evaluación cuantitativa del número de leucocitos por célula epitelial, por campo microscópico a 400X , en el extendido teñido por Giemsa. Esta etapa es fundamental para aumentar la evidencia sobre RIV. En todo caso de dudas sobre valores límites de recuento de leucocitos por campo (fresco, Gram y Giensa) y en todos los casos de BACOVA en mujeres embarazadas se debe recurrir al recuento de leucocitois por célula epitelial por campo en la coloración de Giemsa. 4.4.- Corrección del VN por la adición de dos puntos en caso de la detección de células Guía, para Vaginosis Bacteriana. La detección de CG, en cualquiera de los extendidos, independiente de su número debe significar la corrección del valor numérico básico de Nugent, cuando este se ubica entre 0 a 6. Valores numéricos de 7 o más son considerados de hecho la base del diagnóstico de VB y no requieren corrección. 4.5.- Estudio de las células epiteliales del Contenido Vaginal. Como ya se ha mencionado la determinación de la RIV es de un valor predictivo fundamental en el estudio de la disfunción vaginal y define la orientación del manejo clínico de la mujer en edad fértil con riesgo gineco obstétrico. La RIV significativa, acompañada de VN normal es un indicador de alto valor predictivo de cervicitis o infección del tracto urogenital alto. Este mismo perfil, pero en condiciones de colonizaciuón de levaduras, es de alto valor predictivo de vulvovaginitis . Se deberá informar la presencia de células no habituales del contenido vaginal (Células “redondas”). Esto significa un alerta y a menos que el nivel del bioquímico informante lo amerite, no pretende ser un diagnóstico cito-histológico. Significa la obligación ética y científica de informar la presencia de células que indican la eventual instalación de patologías agudas o crónicas que deben ser inmediatamente confirmadas o no, en niveles de mayor complejidad. Se reitera la necesidad de buscar la existencia de células ajenas al contenido vaginal normal, que podrán ser llamadas células “no habituales en el contenido vaginal”, incluyendo coilocitos (vinculados a infección por HPV), virocitos (células compatibles con infección herpética) y otras células (“redondas”) que indican patologías que van desde una reacción inflamatoria aguda manifiesta (células parabasales) y/o procesos de atrofias de mucosas y formas proliferativas epiteliales, que deberán ser confirmadas clínica y analíticamente. (Ver proyecto ERIGE en la pagina de la FBA). En la actualidad la indicación de coilocitos y virocitos ha sido eliminada en el modelo de informe, dejando solamente el indicador de células no habituales. 4.6.- Tricomonas (TV). La detección clásica de TV es en el estudio en fresco, donde son identificadas con mayor sensibilidad y especificidad en función de la detección de su movilidad. En el caso de no detectarse en fresco y sobre todo en presencia de una respuesta inflamatoria significativa, deberá buscarse cuidadosamente su presencia en los extendidos coloreados con Gram (baja sensibilidad y especificidad) y con más detenimiento en los teñidos con Giemsa, de mayor eficiencia (confirmatorio)Es altamente recomendable la utilización del Fijador colorante azul de metileno (7). En la actualidad se desarrolla un proyecto de validación, para ser incorporado a BACOVA. (item 7). 4.7.- Detección e interpretación de la presencia de levaduras (Lev). La presencia de levaduras es de fácil identificación microscópica, con un alto grado de valor costo beneficio positivo . La interpretación de cuando las levaduras detectadas son responsables de la etiología de una vulvovaginitis escapa al valor predictivo de la sola detección morfológica. Independiente de la apreciación cuantitativa e inclusive detalles morfológicos vinculados con actividad reproductiva (dimorfismo). La sola detección microscópica de levaduras no tiene un valor predictivo (positivo y negativo) válido para tomar decisiones terapéuticas. Sin embargo en BACOVA, asociando la visualización de Le a la elevación significativa de RIV cobra mayor valor predictivo positivo y negativo para Vulvovaginitis. (1,3,5). En virtud de la experiencia adquirida se ha resuelto modificar el informe con respecto a Levaduras. Si se las detecta, se informa presencia y se describen, por si o por no, los datos referentes a dimorfismo y RIV. Se elimina del informe de laboratorio, la expresión: significativa o no. Se reitera que perfiles de RIV significativa, VN entre 0 y 3 y pH normal, son indicadores de alto valor predictivo de vulvovaginitis, cuando simultáneamente se detectan levaduras. 4.8.-Morfotipos bacterianos extraños (Mex) BACOVA pierde valor predictivo en lo referente al diagnóstico morfológico de bacterias no habituales presentes en el contenido vaginal. Se intenta reconocer cuatro perfiles: cocos y bacilos Gram positivos, bacilos Gram negativos, Corineformes y bacterias compatibles con actinomices. En general el informe omite la cuantificación, que carece de valor predictivo. Con una baja frecuencia se presentan casos en los que la presencia de morfotipos extraños ocupa una proporción relativa de gran significación en el extendido en estudio. Se informa esta condición, que en muchos casos compromete la evaluación normal del VN convencional. Mas que la sola presencia de mirfotipos extraños, el estado de RIV es el que define la actitud clínica. De hecho toda morfología que sea compatible con gonococos, debe ser informada como alerta. 5.-Informe de los resultados El informe debe ser predictivo y no descriptivo. Se recomienda organizar la documentación interna en el orden antes desarrollado, que representa un verdadero algoritmo de las evidencias detectadas, de valor clínico. Es muy apropiado disponer de una ficha preimpresa (modelo adjunto) donde registrar los resultados detectados a lo largo de la lectura de los diferentes preparados, documentados el planilas anexas. (anexo 6.3). El informe debe sintetizar resultados concretos a los efectos de orientar decisiones en el manejo clínico terapéutico de la paciente, pero antes se deben analizar en forma integral las evidencias obtenidas y su contribución a los criterios diagnósticos que se desprenden del estudio morfológico. Esta integración es la que hace de BACOVA, la metodología de mayor velor predictivo en el diagnóstico de las patologías más frecuentes en la Disfunción Vaginal (2,3). Se reitera que el informe no debe ser descriptivo y y debe orientar decisiones clínicas concretas, utilizando códigos numéricos de aceptación internacional. Hoy existen publicaciones básicas al alcance de todo el cuerpo médico y bioquímico, que detallan la utilización de BACOVA en el manejo de la Disfunción Vaginal en la mujer en edad fértil. (1,5) Un modelo estándar válido para este informe se presenta a continuación: BALANCE DEL CONTENIDO VAGINAL (BACOVA): Apellido y Nombre de la paciente: Fecha del estudio: Datos preanalíticos:
Estudio del equilibrio de la microbiota vaginalInterpretación de la coloración de Gram según criterio Nugent y con corrección de Lanzafame
Interpretación: 0 a 3 Microbiota Normal; b. 4 a 6 Microbiota Intermedia c. 7 a 10 Microbiota Anormal. En ausencia de Reacción Inflamatoria Vaginal el VN de 7 a 10 define el estado de Vaginosis Bacteriana. Estudio de Respuesta inflamatoria vaginal:
Estudio de Vaginitis convencionales:
Informe detallado de Morfotipos: CONCLUSION: La Dirección Técnica del Laboratorio ha implementado el Manual de Procedimientos BACOVA SALUD REPRODUCTIVA, de la Fundación Bioquímica Argentina (www.fba.org.ar/proeco ) para el estudio de la disfunción vaginal. Ante cualquier duda sobre el resultado y/o interpretación del presente informe no dude en contactarnos.
ESTE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS ESTA VIGENTE A PARTIR DEL 1º DE ENERO HASTA EL 31 DE DICIEMBRE DE 2009 TODO PROFESIONAL INTERESADO PUEDE HACER CRÍTICAS Y PROPUESTAS, QUE SON EVALUADAS EN FORMA PERMANENTE POR EL GRUPO DE COORDINACION DEL PROYECTO BACOVA. (bacova2004@yahoo.com.ar) 6.0.-ANEXOS 6.1.- Técnicas de Coloraciones COLORACION DE GRAM Reactivos: 1 – Violeta de Genciana fenicado: Violeta de Genciana: 10 g. Fenol: 20 g. Alcohol absoluto (96°): 100 ml. Agua dest./ CSP 1000 ml. Disolver el violeta con el fenol previamente fundido a Baño María, en un vaso de precipitado de 2 litros destinado para colorantes, al que se añade el alcohol. Dejar hasta completa disolución aproximadamente 1 día y se completa con agua destilada. Envasar en frasco color caramelo, reposar 1 mes y filtrar para su uso. 2 – Solución de Lugol Yodo: 5 g. Yoduro de potasio: 10 g. (agregar un exceso, aprox.1g. para disolver el yodo) Agua dest.: 1000 ml. En botella color caramelo: poner el IK, previamente disuelto en 100 ml. de agua dest., al que se agrega los 5 g. de yodo. Agitar para disolver el yodo. Completar a 1000 ml. con agua destilada. Tapar la botella y agitar. 3 – Decolorante Alcohol de 96C: 80 ml. Acetona: 20 ml. 4 - Fucsina Fucsina básica: 10 g. Alcohol de 96°: 100 ml. Fenol 95%: 10 ml. Agua dest. CSP 1000 ml. En botella color caramelo: Fucsina básica + 100 ml. de alcohol de 96°+ 10 ml. de fenol. Dejar 48 hs. en estufa a 37°C y se lleva a 1000 ml. con agua destilada. Dejar decantar 1 mes. Filtrar al usar. MÉTODO: Extender, secar y fijar al calor. Cubrir la preparación con Violeta de Genciana y dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua. Cubrir con Lugol 1 minuto. Lavar con agua. Decolorar con alcohol-acetona con cuidado hasta que arrastre el colorante ( las partes más finas del extendido quedan incoloras). Lavar con agua. Cubrir con fucsina diluída al décimo durante 30 segundos. Bacterias grampositivas: se tiñen de color violeta. Bacterias gramnegativas: se tiñen de color rosado. Examen del extendido coloreado por el Gram Con poco aumento se evaluará la conveniencia de la muestra. Cuando se buscan bacterias se usa la lente de inmersión en aceite (x1000). Para evaluar la conveniencia técnica de la coloración se utiliza la lente de inmersión. Se observará la calidad del extendido. Preparados demasiado concentrados (“frotis gruesos”), conducen a errores de interpretación. Excesiva fijación por el calor, puede alterar la morfología normal de las bacterias y las células. La decoloración escasa o excesiva, puede dar variaciones en el resultado de la coloración. Es de importancia, sobre todo al cambiar insumos, realizar sistemáticamente controles, utilizando cepas bacterianas perfectamente identificadas. COLORACION DE GIEMSA Reactivos: Metanol Colorante de Giemsa. Agua tamponada pH 7,2 Técnica: Extender y secar a temp. ambiente. Fijar con metanol 3 minutos. Cubrir la preparación con una dilución acuosa de Giemsa en agua destilada neutra (1 gota de colorante por ml. de agua destilada) Dejar actuar 15 minutos. (La coloración de Giemsa prolongado dura 45-60 min.) Lavar con agua. Secar y observar con objetivo de inmersión. El colorante de Giemsa es una solución en alcohol metílico y glicerina, de eosina, azul de metileno y azur II. 6.2.-Determinación del Valor Numérico En la tabla que sigue se presenta el diagrama de la metodología propuesta por Nugent. DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE NUGENT
El valor numerico se asigna teniendo en cuenta la proporción relativa de tres criterios morfológicos Morfotipo lactobacilos Morfotipo de Bacteriodes (pequeños bastones), Gram variables (Compatibles con Gardnerelas y anaerobios. Morfotipo de bacilos Gram negativos, curvos. Como puede observarse en el valor asignado a cada uno de estos tres “paquetes” morfológicos, el de los bacilos Gram negativos curvos, tiene menor peso que los otros dos. En la práctica uno debe referir a la LECTURA DE UN NÚMERO DE CAMPOS MICROSCÓPICOS, leido con el aumento máximo con objetivo de inmersión. Las “cruces” /+) en cada caso se asignan de acuerdo a la siguiente interpretación de la lectura de cada campo microscopico:
Al momento de realizar el estudio el operador puede documentar sus resultados utilizando indistintamente el sistema de cruces o directamente el número de morfotipos por campo, esta última forma es la recomendada por el Manual del Curso a Distancia de la Asociación Argentina de Microbiología (pag 92). Para lo que puede manejarse el siguiente esquema: Interpretación de la coloración de Gram del contenido vaginal según el criterio de Nugent
6.3.- Planillas d apoyo para realización de BACOVA A continuacion se introduce un modelo de planilla de apoyo para la documentación de la lectura del Gram. BACOVA (apoyo a la lectura del Gram. Puede ser utilizado en las otras lecturas)
Planilla de documentación de proporciones relativas de morfotipos. Paciente: Preparado: Gram Fecha:
RESULTADO FINAL CONFIRMACION INTEGRACIÓN DE CRITERIOS
RESULTADO NUMÉRICO FINAL A INFORMAR 7.-Proyectos de validación
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